甲贝课堂 | mRNA药物之质粒Poly(A)长度及分布测定

前两期mRNA药物系列解读，甲贝课堂给大家阐明了👉mRNA加帽率和👉mRNA的Poly(A)尾分布检测的基本原理，本文则围绕《质粒Poly(A)长度及分布测定》展开。

mRNA药物和质粒Poly(A)尾

目前，大多数mRNA药物的生产要经过序列设计、质粒构建、mRNA的合成与纯化、LNP（lipid nanoparticles）设计生产和制剂灌装等。

图1：mRNA药物的生产

通过IVT合成mRNA时，Poly(A)尾的添加方式有2种：一种是酶法合成，另一种是共转录（由已经存在于模板质粒DNA或者PCR产物上的Poly(A)序列直接转录形成）。当前普遍的Poly(A)尾添加是通过质粒模板共转录来实现的。

在以质粒DNA为模板的共转录加尾实验中，质粒Poly(A)序列的长度和分布，会直接影响终产物mRNA的3’Poly(A)尾长度和分布，进而影响mRNA稳定性和蛋白反应表达。因此，质粒Poly（A）尾的序列分析的准确与否，将直接影响IVT反应合成mRNA的产量、纯度以及体内表达效果。

业界难题之质粒DNA Poly(A)尾的分析

通过大肠杆菌发酵的方式来大规模生产治疗性质粒，是较为成熟的工艺路线。但在质粒发酵生产中，质粒上的Poly(A)序列很容易丢失，造成尾巴缩短的现象，无法实现生产的质粒Poly(A)序列的均一性，难以达到GMP级别生产工艺和药品监管要求。

目前，没有文献报道过基于质谱法分析质粒DNA Poly(A)长度及分布的成功案例，业界对如何获得适合质谱分析的poly(A)片段长度没有经验，对于DNA Poly(A)片段的纯化条件以及后续的数据处理缺乏公认的标准。

甲贝医药mRNA研发团队率先创新，成功搭建了基于质谱法的质粒DNA Poly(A)长度及分布分析平台，研究数据表明:

1.甲贝医药mRNA测试平台能够使用质谱法分析DNA PolyA长度及分布，发现了与理论长度一致的主要成分及1种变体（见下文案例）;2.该平台可对分段式Poly(A)进行分段分析和完整分析，其结果完全一致。

服务内容：★创新高效，3天交付

甲贝医药可根据客户提供的待测Poly(A)尾质粒样品和理论序列，最快可在3个工作日内提供精确高效的限制性内切酶设计服务、LC-MS图谱和质粒Poly(A)尾长度分析。

检测原理

甲贝医药根据质粒序列的特异性，利用限制性内切酶识别质粒序列中对应的酶切位点，酶切质粒得到含有Poly(A)的目标片段（图3左）。随后，利用磁珠进行Poly(A)片段的富集（图3右），再结合高分辨率的液相质谱联用（LC-MS），对质粒Poly(A)尾进行定性和定量分析。

图3：检测原理

分析流程

案例展示

图4：检测案例（更多案例欢迎垂询）

送样建议

1. 1.  样品浓度： ≥1 mg/mL（总量≥300ug）

2. 2.  样品形式：液体、干粉

3. 3.  保存方式：低温（干冰）

-更多业务：mRNA系列-

-蛋白药物系列-

关于甲贝

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